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WB实验条带问题?原因分析和解决方法都在这里

作者:武汉伊莱瑞特生物科技股份有限公司 2022-06-28T14:43 (访问量:7859)

Western Blot虽是实验室最常用的蛋白分析技术,但是由于它步骤繁琐、操作流程长、影响因素多,所以,导致我们在做实验时会遇到各式各样的问题。今天我们总结了一些WB实验中经常遇到的各种“奇葩”条带问题,并为你推荐了常用的解决方法,希望对大家有所帮助。

一、 目标条带没有信号

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原因分析

解决方法

样品中可能含有蛋白酶,使蛋白样品分解成小分子。

添加蛋白酶抑制剂。

目标蛋白浓度过低(低于检测下线)。

加大上样量或提高目标蛋白浓度。

转膜时间太短导致目标蛋白没有充分转移到膜上,或者转膜时间过长导致样品转穿。

控制转膜时间并选择适合的转印膜。

一抗的特异性不佳,导致一抗无法识别目标蛋白。

选用高品质抗体。

一抗反复使用后导致效价降低,尽管还能与目标蛋白连接,但连接蛋白的数量太少。

一抗不宜反复使用。

洗脱过渡导致与一抗相结合的目标蛋白被洗掉。

洗脱时间的时间和频率应有效控制,一般建议3次10分钟。



二. 图片背景过高,难以分辨条带

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原因分析

解决方法

一抗浓度太高,导致抗体非特异性结合。

降低一抗浓度。

洗膜的时间和次数不够,导致其他蛋白没有清洗干净。

提高洗脱时间和频率。

封闭物用量不足。

提高封闭物浓度,孵育时保证封闭液完全浸没转印膜。

封闭物使用不当。

检测生物素标记的蛋白时不可用脱脂奶粉封闭。

封闭时间不够。

室温37度封闭1小时以上,4度封闭过夜。

一抗稀释度不适宜。

对抗体进行滴度测试,选择最适宜的抗体稀释度。

一抗孵育的温度偏高。

建议4℃结合过夜。



三、 膜上出现黑点和黑斑

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原因分析

解决方法

膜上其他部位与一抗或二抗非特异性结合,配置的封闭液可能没有完全溶解,使不容颗粒附着在膜上从而导致发光时候膜上形成黑点。

配置封闭液后最好静止一下,封闭牛奶一定要纯,封闭结束之前要清洗三遍之后再加一抗。

抗体与封闭试剂反应。

使用前过滤封闭试剂。

HRP 偶联二抗中有聚集体。

过滤二抗试剂,去除聚集体。

四、 出现非特异性条带

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原因分析

解决方法

一抗非特异性与蛋白结合,此种情况大多数情况是因为一抗特异性不好。

更换一抗。

目的蛋白有多个修饰位点,有些一抗还能结合其他蛋白的结合位点。

更换一抗品种。

蛋白样品降解,蛋白酶将目标蛋白分解成若干个蛋白,而这些蛋白同样可以被一抗识别。

添加蛋白酶抑制剂。

五、条带中出现整条白色空斑

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原因分析

解决方法

过高的蛋白上样量或一抗和二抗浓度过高都会促使底物过快的消耗,导致我们在做化学发光检测时,发光底物已经消耗殆尽而形成空斑。

减少蛋白上样量、稀释一抗和二抗的浓度。

六、条带中出现白圈

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原因分析

解决方法

转膜时候,膜与胶之间有气泡。转膜时气泡。

制作“三明治”时,注意赶走气泡。通常将电转液倒入一个盘子里,液体高度与第一层滤纸齐平,然后往滤纸上浇一些转膜液,把电泳胶用清水清洗后平铺在滤纸上,随后在确认滤纸与胶之间无气泡后,再往胶上浇一些电转液,之后用双手的拇指和食指轻轻夹住PVDF膜两侧中间,使膜成U型,再将U型底部接触到胶的中间,慢慢往两边放下膜,这样可以减少气泡。上层滤纸同样用U型的放置方法,可以用玻璃棒贴实一下,然后盖上海绵垫。


七、 条带拖尾

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原因分析

解决方法

这种情况很容易出现,因为导致条带拖尾的原因很多,可能性较大的是一抗浓度太高,作用时间太长或蛋白量过大。

根据情况调整蛋白量,同时降低一抗的浓度,缩短一抗的时间。


八、条带变形

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原因分析

解决方法

胶体中存在气泡,或不溶性杂质,胶不均不平整。

配胶时用的小烧杯,水,SDS,tris等等干净无杂质。贴边角加入液体,凝固时避免大幅度动作触碰。

九、条带呈哑铃装

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