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人外周血调节性T细胞鉴定方案

作者:武汉伊莱瑞特生物科技股份有限公司 2022-06-22T15:34 (访问量:2860)

CD127 VS Foxp3

虽然Foxp3是目前公认的调节性T细胞最特异的指标,但因其位于细胞内,使得Foxp3的染色必须要固定细胞并破核膜,因此这种方法并不适用于分离活的Tregs,且该方法比较传统,操作相对复杂,稍有不慎就会影响实验结果

而CD127属于细胞表面Marker,无需固定破膜。因此,当前主流方向是通过CD127来检测人Tregs。

CD127的发现

CD127是2006年被发现的一种检测CD4+CD25+调节性T细胞的新指标。由于不需要将细胞固定破膜处理,检测起来要比Foxp3方便。

研究发现,CD4+CD25+纯化的细胞中,CD127与Foxp3的表达呈负相关。通过CD4+CD127low纯化出的CD4+CD25+ T细胞,与Foxp3纯化的CD4+CD25+ T细胞数量相似,并且这部分细胞展现了CD4+CD25+调节性T细胞的典型特征。CD4+CD25+CD127-/low是较CD4+CD25+Foxp3+更优的特异性检测

配色方案

细胞亚群

种属

指标

荧光标记

克隆号

Treg

Human

CD45

EV450

HI30

CD3

ER780

OKT3

CD4

FITC

RPA-T4

CD8a

PerCP/Cyanine5.5

OKT-8

CD25

PE

BC96

CD127

AF647

A019D5

人Treg鉴定所需流式抗体

产品名称

荧光素

货号

规格

CD45

EV450

E-AB-F1137Q

20T

CD3

ER780

E-AB-F1001S

20T

CD4

FITC

E-AB-F1109C

20T

CD8a

PerCP/Cyanine5.5

E-AB-F1110J

20T

CD25

PE

E-AB-F1194D

20T

CD127

AF647

E-AB-F1152M

20T

人Treg鉴定所需辅助试剂

作用

货号

名称

规格

细胞染色

缓冲液

E-CK-A107

Cell Staining Buffer

100mL

红细胞

裂解液

E-CK-A105

10×ACK Lysis Buffer

100mL

样本管设置

目的

样本

设置

调电压

1

Blank(空白管)

调补偿

2

CD45-EV450

3

CD3-ER780

4

CD4-FITC

5

CD8a-PerCP/Cyanine5.5

6

CD25-PE

7

CD127-AF647

Full Panel

8

CD45-EV450CD3-ER780CD4-FITCCD8a-PerCP/Cyanine5.5CD25-PECD127-AF647

实验步骤

01

在离心管内加入100μL新鲜血,与2mL 1×ACK红细胞裂解液混匀,4℃裂解10min;

02

300g离心5min(裂解完立即离心,防止时间过长损伤细胞),弃掉上清,用移液枪轻轻吸走残液,可以得到白色的细胞沉淀;

03

加入100μL细胞染色缓冲液,重悬细胞,与流式抗体混匀,4℃孵育30min;

04

加入2mL细胞染色缓冲液,300g离心5min,弃掉上清,再加入200μL细胞染色缓冲液,重悬细胞;

05

上机进行检测。

实验结果

人外周血Treg细胞表型分析

解析:

▶ 荧光素间有溢漏,故需要设置单阳管,用于调节补偿;

▶ 本实验取正常人外周血验证

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