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疾病检测新指标-miRNA

作者:台湾华联生物科技股份有限公司 2013-02-05T16:03 (访问量:13142)

MicroRNA(miRNA)是真核生物中广泛存在的一种由 non-coding 区域转录的小片段 RNA,长度仅有 19~25 个核苷酸。根据 miRBase 数据库,在所有物种发现的 miRNAs,至今已超过 2 万个。miRNA 透过与标的 mRNA 的特异性结合,经由 post-transcriptional 基因沉默的途径,抑制蛋白质生合成。推测脊椎动物的基因组中有超过1,000 个不同的 miRNAs,且有将近 1/3 的基因表现受到 miRNA的调控。

和 mRNAs 一样,在不同的组织或发育时期,miRNAs 的表现量也会不同。这些 miRNAs 在细胞生长与凋亡、细胞周期调控、细胞的分化以及个体的发育等过程中扮演重要角色。

在癌症、心血管疾病、糖尿病、神经系统疾病、发炎反应以及自体免疫疾病可观察到 miRNA 表达谱的改变。差异表达的 miRNA 也可能有助于区分疾病状态。miR2Disease 数据库以人工的方式整理了目前已知与人类疾病相关的 miRNA 表达异常(Jiang Q et al., 2009)。分析肿瘤与正常组织,或是不同肿瘤型态之间 表现的差异,可以找到与癌症高度相关的 miRNAs。

miRNA 做为疾病检测生物标记

miRNAs 也存在于人类和其他动物的血清和血浆中,其种类和数量可随着生理状况或疾病而不同。生化分析显示,miRNA 可以抵抗血浆和血清中存在的核糖核酸酶、极端的 pH 值和温度、长期的储存以及反复的结冻解冻循环(Mitchell PS et al.,2008)。利用循环血液中 miRNA 进行疾病诊断或预测疾病发生的非侵入式检测方式,成为近年来生物医学家的研究重点。最先将 miRNA 做为血液中生物标记的是关于 B 细胞淋巴癌(B-cell lymphoma)的研究,在卵巢癌与肺癌病人的周边血液中也发现高量的癌症相关 miRNAs。许多的研究报告都已说明 miRNA 作为肿瘤等疾病诊断与预测的生物标记之潜力。

在2009年,Ji等人发现,血浆生物标记还可以检测心脏的损伤。许多报告指出血浆中 miRNAs与心肌梗塞和心脏衰竭相关。虽然大多数关于疾病的血浆 miRN A检测研究使用 real-time PCR,Tijsen 等人用微数组方法筛选健康对照者与患有心脏衰竭的患者血浆中的miRNA表达差异(Tijsen AJ et al., 2010)。他们的研究结果证明了以微数组平台检测血浆中miRNA的变化,做为心脏疾病的生物标记的可行性。

miRNA 做为感染早期诊断的指标

细菌的感染可能会引发严重的并发症,如败血症(Sepsis)与败血性休克(Septic shock)。高雄长庚医院杨家森医师等人(Hsieh CH et al., 2012)检测血液中miRNA的变化,研究在临床上早期诊断细菌感染的可行性。将来自大肠杆菌血清型 026:B6(Escherichia coli serotype 026:B6)、克雷伯氏肺炎杆菌(Klebsiella pneumoniae)、绿脓杆菌(Pseudomonas aeruginosa )、沙门氏菌(Salmonella enterica serotype Enteritidis)以及粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)等革兰氏阴性菌的lipopolysaccharide(LPS)以腹腔注射的方式注射 4~6 周龄的小鼠,于 2~72 小时后牺牲小鼠,取得全血与肺脏、脑、肝脏、脾脏。萃取的 RNA 以华联小鼠&大鼠 miRNA 芯片(Mouse&Rat miRNA OneArray®)分析 miRNA 的表现,与对照组(只注射PBS)相比有明显的不同(图1)。注射100-μg LPS 6小时后,在肺组织与全血均有15 种上调表现差异超过 2倍的 miRNAs。在大脑中则没有表现向上调控的 miRNA 。下调表现差异超过 2 倍的 miRNAs 数目较多,在肺、肝、脾和血液样本中分别有23, 10, 8, and 51种。大部分在血液中观察到的向下调控 miRNAs 并没有在其他组织中发现相似的情形。

以 real-time RT-PCR 验证血液中差异表现超过 4 倍的 8 种 miRNAs(let-7d, miR-15b, miR-16, miR-25, miR-92a, miR-103, miR-107, and miR-451),在注射100 and 1000-μg大肠杆菌 LPS 6 小时后,miRNAs表现量增加 5~12 倍(图2A)。分析不同时间点的 miRNAs 变化,在注射后 2小时,miRNAs 表现量就有明显的增加,并且维持到至少 6 个小时;24 小时只剩 miR-25 和 miR-92a 有显著的差异表现,72 小时则与对照组无异(图2B)。

miRNAs 是免疫反应的重要调控因子,LPS诱导的 Toll-like receptor 4 (TLR4) 讯息传导(signal transduction)会活化与 nuclear factor-kappa B (NF-κB) and activator protein 1 (AP-1) 相关的 pathways,生成许多与发炎反应有关的 cytokines, chemokines, or leukocyte adhesion molecules。为了了解 TLR4 receptor 在调控miRNAs 表现中所扮演的角色,在 TLR4 receptor knockout小鼠体内注射100-μg LPS后6小时,let-7d, miR-25, miR-92a, miR-103 and miR-107的表现量明显比正常C567BL / 6小鼠低(图3)。

杨医师等人在另一个研究中,分析小鼠在遭受革兰氏阳性菌感染后,血液中miRNA表达谱的变化(Hsieh CH et al., 2013)。枯草杆菌(Bacillus_subtilis)、粪链球菌(Streptococcus faecalis)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)等革兰氏阳性菌的 lipoteichoic acid (LTA),以及不同革兰氏阴性菌的 lipopolysaccharide (LPS),腹腔注射6小时后,以华联小鼠&大鼠 miRNA 芯片(Mouse&Rat miRNA OneArray®)分析小鼠全血 miRNA 的表现,丛聚分析结果如图4所示。注射枯草杆菌的LTA后,miRNA 的表现明显与粪链球菌/金黄色葡萄球菌的LTA 不同,但是 miR-451, miR-668, miR-1902, and miR-1904 这 4 种 miRNAs 的上调表现差异均超过 2 倍。

以 real-time RT-PCR 验证芯片的实验结果,注射 10-μg LTA 6 小时后,只有 miR-1902 表现量有显著的增加,将剂量提高至1000-μg,4 种miRNAs 的表现则增为 3~6 倍(图5A)。分析不同时间点的 miRNAs 变化,在注射 100-μg LTA 后 6 小时,miR-451, miR-1902, and miR-19042表现量有明显的增加,但是在注射 24 小时后,只剩 miR-451 有显著的差异表现;2 小时与 72 小时则与对照组无异(图5B)。

血清中 miRNA 的变化与全血中的实验结果相似,除了在注射 10-μg LTA 6 小时后,miR-1904表现量也有显著的增加(图6A);此外,注射100 μg LTA 后 2 小时就可以观察到 miR-1902 and miR-1904 表现量的增加,注射 24 小时后,只剩 miR-1902 有显著的差异表现(图6B)。白血球中的 miRNA 表现则没有任何改变(图7A)。

TLR2 receptor knockout 小鼠在接受 LTA 注射后,miR-451, miR-668, miR-1902, and miR-1904 的表现则增为 6~10 倍(图7B),甚至比正常 C567BL / 6 小鼠还高(图7B)。

小结

由上述两篇研究报告的结果,证明了小鼠遭受革兰氏阳性菌或阴性菌感染后,血液中miRNAs的表现有明显的差异,或许可做为细菌感染的早期诊断生物标记。

miRNAs 的发现使我们对于基因表现的调控系统有了新的思维,并帮助我们找到许多疾病的病因。一个 miRNA 分子可以同时调控数十个以上的基因表现,找寻到数个 miRNA 分子的表现变化,就可以为研究带来许多新的视野与方向。利用miRNA microarray 分析 miRNA 表达谱,可快速筛选出许多具有表现差异的 miRNAs ,是研究miRNA 在疾病中所扮演的角色的第一步。再针对个别 miRNA 的深入研究,将有助于了解致病机制,开发新的临床诊断工具甚至是新的治疗方法。

参考文献

(1) Hsieh CH et al. Whole blood-derived microRNA signatures in mice exposed to lipopolysaccharides. J Biomed Sci. (2012) 19(1): 69

(2) Hsieh CH et al. Circulating microRNA signatures in mice exposed to lipoteichoic acid. J Biomed Sci. (2012) 20(2)

(3) Jiang Q et al. miR2Disease: a manually curated database for microRNA deregulation in human disease. Nucleic Acids Research(2009) Jan; 37 (Database issue): D98–104.

(4) Tijsen AJ et al. MiR423-5p as a circulating biomarker for heart failure. Circ Res. (2010) Apr; 106(6): 1035-1039.


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