从头测序（de novo sequencing）是蛋白质组学研究中的关键技术，特别适用于缺乏参考数据库或存在未知蛋白变体的生物体系。相较于依赖数据库比对的质谱鉴定方式，从头测序通过直接解析质谱数据中的肽段离子信息，推断其氨基酸序列，从而实现更全面、更精确的蛋白质识别。

一、从头测序的原理与优势

从头测序是指在无参考数据库或数据库信息不完善的情况下，通过质谱（MS/MS）数据直接推断肽段序列的技术。其主要原理是利用串联质谱中b离子和y离子的断裂模式，分析每个片段的质量差异，从而还原出肽链的氨基酸序列。

从头测序具有以下优势：

• 能识别物种特异性蛋白或突变体，适用于非模式生物
• 对于具有PTM（翻译后修饰）的未知肽段具有更强适应性
• 可发现数据库中未收录的新肽段和蛋白质异构体

二、影响从头测序准确率的关键因素

1、MS/MS谱图质量

从头测序的基础是MS/MS谱图的清晰度和碎裂完整性。优质的谱图具备以下特征：

• 丰富且连续的b/y离子系列
• 高信噪比（S/N）
• 最小化中性丢失和多电荷干扰

若谱图缺乏关键离子信息，即使使用先进算法也难以准确还原序列。

2、离子碎裂方式

不同碎裂方式对谱图质量和肽段信息影响显著。

• CID（碰撞诱导解离）：常用于传统测序，但对长肽段和带有修饰的肽段效果不佳
• HCD（高能碰撞解离）：保留更多高m/z值离子，适合高分辨率分析
• ETD/EThcD：适用于识别翻译后修饰和保留侧链信息的测序任务

3、肽段长度与序列复杂性

过短的肽段容易产生重复序列，导致序列歧义。过长的肽段则可能因碎裂不完全，信息丢失。此外，氨基酸组成也影响断裂倾向。

三、数据分析流程的优化策略

1、选用高性能的从头测序算法

当前主流的从头测序软件包括 PEAKS、Novor、pNovo 等，它们各具特色：

• PEAKS：结合数据库搜索与从头测序，适合高通量分析
• Novor：实时处理MS/MS数据，适合在线质谱平台集成
• pNovo：基于机器学习优化的打分系统，提高肽段识别精度

合理选择算法，并根据质谱平台调整参数，是提升准确率的第一步。

2、结合混合策略提升置信度

即便从头测序结果具有一定不确定性，仍可通过如下方法增强结果置信度：

• 数据库匹配验证：将从头推断的序列用于二次数据库匹配确认
• 一致性筛选：在不同样本、重复实验中筛选稳定存在的肽段
• 融合多谱图信息：同一肽段多次碎裂谱图进行合并分析，有助于识别低丰度肽

3、多维质量控制体系

建立系统的质量控制流程有助于排除低可信度序列，常用方法包括：

• 控制全局FDR（False Discovery Rate）；
• 设置打分阈值（如PEAKS score ≥ 80）；
• 去除存在大量中性丢失或仅有单一离子系列的谱图。

四、从实验设计提升从头测序效率

1、蛋白质酶解策略

• 组合酶解（如胰蛋白酶+糜蛋白酶）提高覆盖度
• 非特异性酶解生成更丰富的肽段组合
• 靶向长肽段切割策略，配合ETD提高识别率

2、上样量与分离策略

蛋白质的上样量需精细控制——过低信号不足，过高则导致离子抑制。可以通过以下手段优化：

• 使用高效的纳升液相色谱系统（nanoLC）提高分离度
• 引入多维分离策略，如高pH反相色谱+低pH分离串联
• 采用在线浓缩提高低丰度肽的检测率

3、选择合适的质谱平台

• Orbitrap平台（如Exploris、Fusion Lumos）：具备高分辨率、快扫描速率
• Q-TOF质谱：适用于需要较高精度和速度的实时定序
• 具备多种碎裂模式的质谱系统，可支持复杂样本中的修饰识别

从头测序不仅在非模式生物、未知修饰蛋白识别中展现出强大优势，也为临床标志物发现、抗体测序等前沿领域打开新路径。掌握从头测序的核心技术，优化实验与数据分析流程，将显著提升蛋白质组学研究的深度与广度。百泰派克生物科技持续优化从头测序服务方案，助力科学家挖掘每一个关键序列的潜力。

百泰派克生物科技特色项目

一、蛋白测序

百泰派克生物科技使用Thermo公司新推出的Obitrap Fusion Lumos质谱仪及岛津公司埃德曼降解测序系统对蛋白质序列进行分析，提供基于质谱的蛋白测序分析服务，包括对蛋白质的氨基酸组成分析，N端测序，C端测序和全序列分析，以及基于埃德曼降解的蛋白质N端序列分析服务。对于未知理论序列的蛋白质，提供基于从头测序法的蛋白质从头测序服务，对蛋白序列进行分析。

※服务优势：

1.采用目前世界上先进的质谱仪器 Obitrap Fusion Lumos;

2.可实现对所测定靶蛋白序列 100% 的覆盖;

3.可测定蛋白N端多达 70个氨基酸序列;

4.可测定多种形式的样品: 蛋白溶液、PVDF 蛋白条带;

5.样品用量低: 蛋白样品仅需 5-10ug，即可完成检测;

6.测序不受N端封闭，PEC和和糖基化等N端修饰的影响。

二、蛋白质组学

百泰派克生物科技采用Thermo Fisher的Orbitrap Fusion Lumos质谱平台结合Nano-LC，提供定量蛋白质组学、靶向蛋白质组学、多肽组学、翻译后修饰蛋白组学等多种蛋白质组学分析服务。此外，百泰派克生物科技新推出基于timsTOF Pro的4D蛋白质组学服务，助力微量样本蛋白组学、大样本群医学及高通量修饰组学等研究工作。

※服务优势：

1 .高通量定量蛋白分析:多对照组大规模实验分析，发现新的生物标记物;

2.体内体外多种蛋白质标记方法，适用于分析组织、细胞、血液等多种样品;

3.质谱分析灵敏度高，实验结果重复度高;

4.可检测较低丰度蛋白，线性范围广;

5.专业生物信息学分析，分析更系统准确。

三、单细胞质谱流式技术分析

百泰派克生物科技采用Fluidigm质谱流式系统进行单细胞质谱流式技术分析，采用金属元素标记物（通常是金属元素标记的特异抗体）标记细胞表面和内部的分子，然后用流式细胞原理分离单个细胞，再用电感耦合等离子体质谱（ICP-MS）分析单个细胞的原子质量谱，最后将原子质量谱数据转换为细胞表面和内部的信号分子表达量。

※服务优势：

1.技术先进，填补技术空白

采用金属标记抗体技术，避免了传统流式荧光通道少且易相互影响的问题。可在单细胞层面上对多种指标同时进行表征，百泰派克生物科技可做到同时检测51个目标蛋白。

2.分析数量大，成本较低

单细胞RNAseq受成本等因素限制，所有样本细胞汇总的分析数目一般在2x10^4个左右，而流式质谱技术一次（单样本）就可分析至少10^5的细胞，实现了数量级的提高，且成本不高于单细胞RNAseq。

3.应用前景大

①流式质谱结果可以给出细胞亚群的变化，在临床诊断、疾病机制研究等方面具有极大的研究前景；

②将金属标签技术与其他技术结合会有新应用方向。除常规蛋白外，质谱流式细胞技术还可用于蛋白翻译后修饰；

③可检测细胞存活率、细胞大小、mRNA转录子表达量、DNA合成速率以及蛋白酶活性等。

四、基于高精度质谱的免疫多肽组学分析及新抗原发现

百泰派克生物科技的基于高精度质谱的免疫多肽组学分析及新抗原发现一站式解决方案包括我们专有的、高度敏感的免疫肽富集和鉴定方案。我们能够帮助您实现10,000个以上I型多肽和10,000个以上II型多肽的鉴定和识别。通过我们优化的高通量免疫多肽组学分析平台进行免疫肽组学分析，可从最小的样品材料中进行可重复的识别和定量。该服务可以应用于大规模的研究，旨在助力科研工作者寻找癌症、免疫疾病及传染病的解决方案，深入挖掘未知的靶标。

五、生物药物表征

百泰派克基于高分辨率质谱技术，MALDI TOF，高效色谱分离技术，提供一系列完善的生物药物分析方案，从蛋白质、多肽、抗体、疫苗等生物制品的氨基酸组成和一级结构分析，到产品变异性和纯度分析。旨在提供优质生物药物分析服务，帮助生物医药生产商提高生物药物品质。

百泰派克生物科技七大检测平台

百泰派克生物科技-生物制品表征，生物质谱多组学优质服务商

北京百泰派克生物科技有限公司致力于为生物/制药和医疗器械行业提供质量控制检测和项目验证等专业服务。公司实验室遵循NMPA、ICH、FDA和EMA等的法规和指导原则，通过CNAS/ISO9001双重质量体系认证，建立了完备的质量体系，数据冷热/异地备份，设备定期计量/期间核查，软件审计追踪，为客户提供一体化解决方案和技术服务，支持新药研发、药物申报注册和生产放行。

1.公司采用ISO9001质量控制体系，专业提供以质谱为基础的CRO检测分析服务；

2.获国家CNAS实验室认可，为客户提供符合全球药政法规的药物质量研究服务；

3.业务范围覆盖蛋白质组学、多肽组学、代谢组学、生物药物表征、单细胞分析、单细胞质谱流式、生信云分析以及多组学生物质谱整合分析等；

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6.致力于为您提供优质的生物质谱分析服务!

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