Cy3-N-羟基琥珀酰亚胺酯荧光素染料
产品名称: Cy3-N-羟基琥珀酰亚胺酯荧光素染料
英文名称: Cy3 NHS Ester
产品编号: 40777ES03
产品价格: 0
产品产地: 翌圣生物
品牌商标: Yeasen
更新时间: 2024-12-10T11:21:51
使用范围: null
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产品信息
产品描述
Cyanine 3(Cy3),是花青素荧光素染料家族的成员之一,是化学合成的聚甲炔染料。目前Cyanine系列染料以两种异构体的形式供货,一种是非磺化花青素(non-sulfonated cyanines),一种是磺化花青素(sulfonated cyanine)。两者的光谱性质几乎一致,因此大部分应用可相互替换,比如,都可用于标记DNA或蛋白等生物分子。两者的主要区别在于:磺化染料是水溶性的,在水相的标记反应体系内不需要使用有机共溶剂,并且降低染料在水中聚集的可能性,增强标记效率。
本Cyanine 3(Cy3)是以磺化染料的形式供货,易溶于水,Ex=555 nm,Em=565 nm,具有明亮荧光,光稳定性强,pH非敏感性等优点,适用于标记多肽、蛋白以及核酸等生物分子,以通过后续荧光成像以及其他荧光生物学方法分析目的蛋白。
本Cy3 NHS ester,即含N-羟基琥珀酰亚胺(N-Hydroxysuccinimide)活化基团的Cy3,可直接与生化分子上的氨基(-NH2)反应形成稳定的酰胺键,主要是伯胺。
产品性质
运输和保存方法
冰袋运输。-20℃干燥避光保存,有效期1年。
注意事项
1)NHS ester基团对湿度非常敏感,务必干燥保存产品。使用前产品需放到室温回温至少20min。
2)NHS ester基团的水解发生在水溶性缓冲体系属于竞争性反应。对蛋白/多肽(浓度:1-1mg/ml)伯胺的连接反应建议在pH 7-9范围内进行。使用不含氨基的缓冲体系,pH 7-9。比如100 mM 磷酸钠,150 mM 氯化钠, pH 7.5; 100mM Hepes, pH 7.5。100 mM 碳酸钠/碳酸氢钠, pH 8-9;或100mM 硼酸缓冲液, pH 8-9。
3)不要使用含伯胺的任何缓冲液,比如Tris,甘氨酸。
4)为了您的安全和健康,请穿实验服并戴一次性手套操作。
使用方法(用Cy3-NHS Ester 标记抗体)
【注意】:可参考本方法进行多肽,蛋白或者其他分子的标记,需要根据具体的实验体系对合适的标记缓冲体系,样本浓度,染料浓度等参数做出合适的调整。
1)用不含氨基的合适的缓冲液(eg.100mM磷酸钠,150mM NaCl, pH7.5)溶解抗体使其浓度达到1-5mg/ml。【注】:如抗体中有残留Tris或 glycine 污染,则需透析或者脱盐到合适的缓冲液内。
2)使用前,用适量去离子水或者无水DMSO溶解Cy3-NHS,使其摩尔浓度为抗体摩尔浓度的400倍,例如,待标记的IgG浓度为1mg/ml(eg 6.7μM),则溶解后Cy3-NHS的浓度为2.7mM;如待标记的IgG浓度为2.5mg/ml,则溶解后Cy3-NHS的浓度为6.75mM;
3)向抗体中加入适量Cy3-NHS试剂,以达到预期的标记效率。【注】:当用Cy 3 NHS ester标记抗体或其他蛋白,亮度最高的偶联物其染料/蛋白的比率为4-12,取决于特定的应用。过高比率会增加非特异性背景,丧失抗体特异性结合,导致聚集。建议根据应用优化标记比率。
4)室温孵育60min(或更长);
5)利用合适缓冲液透析或脱盐柱去除未反应的试剂;
6)分别在280nm和550nm检测Cy3-抗体的吸光值;
7)测定Cy3标记效率(DOL)和标记浓度。见下公式。
应用举例
用高于抗体摩尔浓度20倍的Cy3-NHS标记 0.1 ml山羊IgG(浓度为1mg/ml)。标记后脱盐去除未标记染料,在PBS中测定(1:5稀释)测定其A280和A555:
A280=0.2906
A555=0.9825
另:山羊IgG分子量为150kDa, E1%=13.6 or 204000M-1cm-1
计算DOL如下:
By Equation 2 Molarity of Cy3 dye=0.9825/150000 M-1cm-1=6.55μM
By Equation 3 Molarity of IgG =0.2906-(0.9825×0.08)/204000 M-1cm-1=1.039μM
By Equation 1 number of Cy3 per IgG=6.55μM/1.039μM=6.3
则计算Cy3-IgG protein 浓度为(mg/ml):
By Equation 4 mg/ml=[0.2906-(0.9825×0.08)/1.36]×5=0.78mg/ml