猪转化生长因子-b1(TGF-b1)ELISA试剂盒-分析方法-资讯-生物在线

猪转化生长因子-b1(TGF-b1)ELISA试剂盒

作者:上海西唐生物科技有限公司 2011-10-08T00:00 (访问量:2394)

猪转化生长因子-b1(TGF-b1)ELISA试剂盒

原理

本实验采用双抗体夹心 ABC-ELISA法。用抗猪 TGF-b1 单抗包被于酶标板上,标准品和样品中的 TGF-b1与单抗结合,加入生物素化的抗猪TGF-b1,形成免疫复合物连接在板上,辣根过氧化物酶标记的Streptavidin与生物素结合,加入底物工作液显蓝色,最后加终止液硫酸,在450nm处测OD值,TGF-b1浓度与OD值成正比,可通过绘制标准曲线求出标本中TGF-b1浓度。

试剂盒组成2-8℃保存)

酶标Coated Wells

96

酶标抗体工作液(Enzyme Conjugate

12ml

10×标本稀释液(Sample Buffer

12ml

20×浓缩洗涤液(Wash Buffer

50ml

标准品Standards1.2ng/

2

底物工作液(TMB Solution

12ml

第一抗体工作液(Biotinylated Antibody

12ml

终止液Stop Solution

12ml

准备试剂与收集血样

1. 收集标本:血清、血浆(EDTA)、细胞培养上清液、组织匀浆、尿液等尽早检测,2-8保存48小时;更长时间须冷冻(-20 -70 )保存,避免反复冻融。

2. 标准品液配制:使用前加入0.3ml蒸馏水混匀,配成4000pg/ml的溶液设标准8管,管加入标本稀释液200ul。在第一管中加入4000pg/ml的标准品溶液200ul混匀后用加样器吸出200ul,移至第二。如此反复作对倍稀释,从第七中吸出200ul弃去。第八为空白对照。

3. 10×标本稀释液用蒸馏水作1:10倍稀释(示例:1ml浓稀释液+9ml蒸馏水)。

4. 洗涤液:用重蒸水1:20稀释(示例:1ml浓缩洗涤液加入19ml的重蒸水)

标本激活方法

  1.   450ul标本稀释液加入到一支1.5ml进口聚丙烯管中,再加10ul血清或血浆标本。

 2.   20ul 1 N HCI,盖紧,上下混匀。28放置60± 2分钟。

     3.   20ul 1 N NaOH,盖紧,上下混匀。

     4.   即用,或放-20/-70保存3天。计算结果时乘以稀释倍数50注意:不同的标本TGF-β1的水平可能有较大差异,请根据实际情况灵活掌握稀释度)

     5.   细胞培养上清或组织匀浆10倍稀释(410ul的标本稀释液+50ul样本+20ul1N HCI+20ul1N NaOH)

6.   尿液直接活化1.4倍稀释(100ul尿液+20ul1N HCI+20ul1N NaOH

检测程序

1. 加样:每孔各加入标准品或待测样品(已激活)100ul,将反应板充分混匀后置37120分钟。

2. 洗板:用洗涤液将反应板充分洗涤4-6次,向滤纸上印干。

3. 每孔中加入第一抗体工作液100ul。将反应板充分混匀后置3760分钟。

4. 洗板:同前。

5. 每孔加酶标抗体工作液100ul。将反应板置3730分钟。

6. 洗板:同前。

7. 每孔加入底物工作液100ul,置37 暗处反应15分钟。

8. 每孔加入100ul终止液混匀。

9. 30分钟内用酶标仪在450nm处测吸光值。

结果计算与判断

1. 所有OD值都应减除空白值后再行计算。

2. 以标准品2000100050025012562.531.2pg/ml为横坐标,OD值为纵坐标,在坐标纸上作图,画出标准曲线。

3. 根据样品OD值在该曲线图上查出相应TGF-b1含量,再乘上稀释倍数即可

试剂盒性能

  1.   灵敏度最小的TGF-b检测浓度小于15pg/ml

2. 特异性:可同时检测重组或天然的猪TGF-b1不与猪其它细胞因子有交叉反应。

3. 重复性:板内、板见变异系数均小于8.9%。

注意事项

  1.   以上标准孔及待样品均建议做复孔,每次测定应同时标准曲线。

 2.   洗涤过程很关键。洗涤不充分将导致精确度误差及OD值错误地升高。

  3.   板条开封后剩余板条要再封好,保持板条干燥

  4.   本试剂盒宜置4oC冰箱保存。

 5.   本试剂盒仅用于科研,不能用于临床诊断!

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