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指南与共识丨宏基因组高通量测序技术应用于感染性疾病病原检测中国专家共识

作者:菁良科技(深圳)有限公司 2021-05-27T11:23 (访问量:5536)

感染性疾病一直备受临床关注,新型冠状病毒肺炎全球大流行,更让病原的精准快速检测成为关注的热点。


目前,因缺乏规范、检测质量良莠不齐、临床对NGS应用的适应证认识不足等多方原因,导致NGS技术在临床应用和普及受到了限制。该共识的推出也是为了促进该技术规范和发展,为临床抗感染诊治能力提升提供帮助。

此次菁良从中选取了部分共识要点以作分享,并给大家带来我们的针对性解决方案。

mNGS技术应用于感染性疾病的适应证

目前因为尚无任何国家官方机构正式批准的适应证或推荐领域,所以所有mNGS结果原则上都需要其他方法验证。从临床角度,mNGS结果不能单独作为病原学确诊或排除的证据。

(一)临床适应证

  • 共识2:患者表现为发热或发热症候群,病因未明确(符合不明原因发热定义),考虑感染或不除外感染,但规范性经验抗感染治疗无效,考虑应用常规技术检测的同时,或在其基础上,开展mNGS。
  • 共识3:各种原因导致患者急危重症表现,不除外感染所致,或考虑继发或并发危及生命的严重感染,建议常规检测的同时,或在常规检测基础上,开展mNGS。
  • 共识4:免疫受损患者疑似继发感染,常规病原学检查未能明确致病原或/和规范性经验抗感染治疗无效,建议进一步完善常规病原学检测的同时,或在其基础上,开展mNGS。

其他对于疑似局部感染、高度疑似感染性疾病、难以鉴别的慢性感染等,在考虑常规检测的同时,或可在其基础上,开展mNGS。

(二)微生物学适应证

  • 针对微生物,考虑出现疑似新发病原体,或某特殊病原体[29, 30, 31, 32],缺乏传统技术或传统技术手段不能确定种属时
  • 对于临床高度怀疑微生物所致的感染性疾病,多种传统技术反复检测不能明确致病微生物的情况
  • 怀疑同时存在其他病原感染时
  • 临床表现提示已明确或高度怀疑的病原体可能具有特殊的毒力表型,需要了解其毒力因子的相关信息时

以上多种情况,建议常规检测的同时,开展mNGS,并继续完善更多检测技术。

(三)流行病学和感染控制学适应证

  • 共识16:出现某种疾病的聚集性发病或暴发,怀疑是微生物导致的感染性疾病但病原不明,且常规快速检测无结果时,建议完善常规检测的同时或在其基础上开展mNGS明确致病微生物。

感染性疾病的暴发是临床和疾控工作的焦点。2019年底,我国学者就是借助mNGS技术,仅仅数天时间就确认新冠肺炎是由一种新的冠状病毒引起的呼吸道传染性疾病。

mNGS的基本流程和管理要求

临床微生物实验室mNGS的基本流程包括标本采集、运送、核酸提取和富集、建库测序和生物信息分析来鉴定感染的病原体。

 

标本采集
共识18:

  1. 从正常无菌部位采集mNGS检测标本,应严格无菌操作,避免污染;
  2. 从有菌定植或污染部位采集的标本,应采取必要措施,尽量减少污染;
  3. 用于宏基因组RNA测序的标本,应添加核酸稳定剂。

mNGS标本的运送须防污染、防震荡、冷链快速运送;标本如不能及时检测,应保存于低于-70 ℃冰箱或液氮(血液标本应分离血浆后保存)

DNA/RNA提取

DNA/RNA提取方法是导致mNGS结果差异的一个重要因素。
共识19:

  1. 建议实验室的核酸提取流程、病原体核酸提取试剂盒应经过验证;
  2. 高宿主背景标本提取时应采用经过验证的方法去除宿主细胞或核酸;

整个提取过程必须有防污染措施,包括阴性对照和阳性对照等。
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建库和测序
大部分mNGS建库过程需要进行扩增。不同物种的克隆扩增效率不同,这会导致背景污染的物种读长数变得很高,mNGS结果判断更加困难。
共识20:

  1. 建议采用经过验证的流程进行建库和测序;
  2. 建库慎用各种扩增方法,因为扩增会使正常菌群或污染病原体的序列扩大,难以判断真正病原体;

测序原始数据应进行质控,并且过滤掉低复杂度、低质量的序列,确保测序原始数据的质量。
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生物信息学分析
生物信息学分析流程必须经过性能确认和验证,包括将对照和患者数据集进行分析和比较,并通过常规临床测试来确定最终结果的准确性,目前尚缺乏标准。

mNGS应用于感染性疾病病原诊断的质量管理保证
mNGS检测的质量控制对于确保性能准确至关重要。由于mNGS是复杂的多步骤测试,因此需要多个质量控制指标,包括样品对照、外部对照、内部对照、文库质量指标、测序质量指标和污染对照。

mNGS应用于感染性疾病病原诊断的性能验证和标准化
mNGS检测微生物的性能、有效性和临床意义是亟待解决的问题。

  • 共识28:对mNGS整个检测和分析流程进行性能验证是其应用于临床的瓶颈,建议对感染性疾病常见的“代表性”物种进行检出限、包容性、抗干扰、精密度、携带和交叉污染、稳定性等的验证。


菁良解决方案
mNGS检测的设计、分析性能和报告间的差异使得验证、质量控制和能力测试标准化成为一项艰巨的挑战。

菁良基因定制宏基因组测序质控品,可包含一种或多种细菌真菌类微生物,并有菌液,核酸溶液等多种产品形式可选。

用户可根据检测需求,定制包含不同种类微生物,不同产品形式,不同规格等的质控品。

■定制内容


■产品特点

  • 菌种丰富:革兰氏阳性菌,革兰氏阴性菌,真菌等多种可选
  • 菌种可混合:可根据客户需要提供单种菌类及混合多种菌类的产品
  • 产品形式多样:菌株及菌株gDNA形式可选


■产品应用

  • 注册报证:试剂盒内阳性质控品,企业参考品
  • 日常质控:评估检测流程稳定性,可靠度,一致性,再现性
  • 平行测试:室间质评,试剂盒平行比较,测试平台比较
  • 生信评估:生信建模及流程测试,流程开发

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在未来,菁良基因期待通过进一步规范该项技术在临床的应用及质量控制,探索mNGS在耐药基因检测、宿主免疫监测、病原体定量等领域中的落地前景,推动传感染病精准诊疗的发展!



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