由于光学检测具有高的时空分辨率、高灵敏度和安全的非电离辐射，人们为开发用于传感应用的光学纳米颗粒付出了巨大的努力。光学纳米颗粒具有信号放大和多重检测的能力，在体外诊断中具有独特的地位。光学纳米颗粒是很有前途的诊断工具; 然而，它们较浅的光学成像深度和较慢的清除速度阻碍了它们用于体内疾病检测。

2022年4月14日，浦侃裔课题组在NATURE MATERIALS上发表了题为Renal clearable polyfluorophore nanosensors for early diagnosis of cancer and allograft rejection的研究成果。

该课题组开发了活化多荧光基团纳米传感粒子，此传感粒子可以通过生物标志物激活纳米粒子到分子的转换，并且具有对近红外荧光反馈的能力。此传感器可以在疾病发生区域积累，并与疾病相关的蛋白酶进行反应，促进原位酶催化解聚。这种疾病特异性的相互作用可以激活多氟载体纳米传感器中可肾脏代谢的荧光片段，用于无创纵向尿液分析，并优于血液和尿液分析黄金标准，其敏感性和特异性水平可与有创活检和流式分析相媲美。此研究成果有望通过简单的尿液测试应用于一系列疾病的早期诊断。

该研究中报道了可激活的多荧光团纳米传感器(APNs)的开发，具有生物标志物触发的肾脏清除和荧光反应，用于无创近红外荧光(NIRF)在体内成像和尿液分析。APN是通过烷基链上叠氮基团的荧光团(NH2CyOH)和苯胺基团级联的自燃连接剂(4-氨苯基共轭苯炔二甲醇)缩聚而成的。自灭接合体的苯胺基团被二肽acetyl-Phe–Lys (Ac-FK)或四肽acetyl-Ile–Glu–Phe–Asp (Ac-IEFD)固定，Ac-FK和Ac-IEFD别是CatB27和GzmB28的特定底物。这些肽偶联的自灭性单体分别与NH2CyOH聚合形成聚合物C和聚合物G，聚合物C/G侧链上的叠氮基进一步与炔基化hydroxypropyl-β-cyclodextrin (HPβCD)或炔基化 cyclic arginine–glycine–aspartate motif (cRGDfK)通过链接反应分别生成APNC和APNG。

图1 各APN的蛋白酶反应肽刷(肽序列:Ac-FK和Ac-IEFD)、肾脏代谢部分(HPβCD)和靶向部分(cRGD)的化学结构

在激活状态下，蛋白酶切割肽刷，诱导级联自消除解聚APN主干，释放可代谢的荧光基团片段，用于NIRF成像和尿液分析。两种蛋白酶， cathepsin B (CatB)和 granzyme B (GzmB)，分别与肿瘤进展和异体移植排斥反应中的淋巴细胞激活相关，被选择作为构建APN的生物标志物。

图2 纳米粒子到分子的药代动力学转换和APN用于成像和尿液分析的荧光开启的分子机制

该项研究中使用的 GzmB (C765, Novoprotein) 来自近岸蛋白，同时，近岸蛋白还提供系列工具酶及重组蛋白等。

癌症的早期诊断对治疗和提高生存率至关重要。然而，由于现有方法的灵敏度和特异性较低，对于检测超小肿瘤(<2mm)仍然具有挑战性。该研究在原位肝肿瘤模型中进一步评估了APNC对肿瘤实时成像和尿液分析的可行性，注射APNC后通过测定尿CyCD检测瘤内CatB水平。在肿瘤植入后的3、8和14天，这些信号分别比对照组小鼠增加了1.8倍、3.8倍和7.8倍。 尿液中活化的APNC百分比与肿瘤大小密切相关。基于APNC的尿液分析可以检测到直径小于1.9毫米的原位肝肿瘤。

图3 APNC在活体小鼠原位肝肿瘤成像和尿液分析中的作用机制示意图

图4 不同组小鼠注射APNC后尿液中活化APNC的NIRF强度

图5 线性回归分析研究尿液中活化的APNC百分比与肿瘤大小的相关性

实时监测活化T淋巴细胞的存在对诊断免疫介导的疾病和实体器官异体移植排斥至关重要。在concanavalin A (con-A)诱导的小鼠急性免疫介导型肝炎模型上观察APNG对活化T淋巴细胞的监测能力。治疗后5h(5.5倍)首次观察到NIRF增强;8h后继续升高(7.3倍)，12h后下降(5.0倍)。

图6 con-A诱导的急性免疫介导型肝炎APNG感应机制示意图

图7 Con-A 处理2、5、8或12小时后注射APNG的活鼠和尿液样本的NIRF图像

原位肝移植是终末期肝病患者的选择，然而异体移植排斥反应仍然是移植后的主要并发症。有创活检是诊断异体移植排斥反应和监测免疫抑制药物治疗疗效的常规标准。然而，此手术可引起继发性损伤，仅提供静态和局灶性病理状态。因此该研究用大鼠急性肝移植排斥反应模型来评估APNG的检测效果是否更加有效。

以健康小鼠移植前尿液信号为基线，在移植后3 d(3.2倍)首次观察到NIRF对尿CyCD的增强(图6b)，在移植后4 d和6 d分别增加到4.9倍和3.9倍(图6b)。Tac治疗后，低剂量时信号下降到1.8倍，高剂量时甚至回落到基线水平。

图8 肝移植手术过程示意图，肝异体移植排斥反应机制，移植肝中活化的APNG用于活体大鼠光学尿检

图9 注射APNG后8 h，各组大鼠尿中CyCD排出量的NIRF强度

基于APNC的纵向尿液分析能够超灵敏地检测直径小于~1.6mm(皮下结直肠癌)和~1.9mm(原位肝癌)的小肿瘤。该技术的灵敏度要比许多临床成像技术更高。此外，APNC的敏感性等同或高于现有的的无机纳米传感器，在肺腺癌小鼠模型中，肿瘤的LOD下降到~1.8mm。鉴于肿瘤小于5mm时，癌症治疗达到全身治愈的可能性很大，APNC可能成为一种理想的早期癌症诊断尿液测试技术手段。

在可激活的多荧光团纳米传感器(APNs)模型中，基于APNG的尿液分析被证明与流式细胞术和活检一样敏感，但具有无创和动态的优势。T细胞浸润的检测早于超声检查和肝胆显像，临床检测(AST、ALT、ALP)和组织学检测。另外，基于APNG的尿液分析将急性异体移植排斥反应与创伤和局部炎症区分开来，这是血液检查所不能做到的。因此，该研究不仅提供了将光学纳米颗粒转化为体内传感粒子的新机会，而且创造了一个通用的纳米平台，填补了超敏尿液测试技术应用于早期疾病诊断的空白。

近岸蛋白相关产品

苏州近岸蛋白质科技股份有限公司，是一家专注于重组蛋白应用解决方案的高新技术企业，主营业务为靶点及细胞因子类蛋白、重组抗体、酶及试剂的研发、生产和销售，并提供相关技术服务。公司定位为医疗健康与生命科学领域原料与技术解决方案的上游供应商，致力于为下游客户提供及时、稳定、优质的产品及服务，助力全球生物医药企业和研究机构的技术与产品创新升级。

详询www.novoprotein.com.cn或致电400-600-0940。