【名 称】                                                                  

中文名：乙型肝炎病毒cccDNA（HBV-cccDNA）核酸扩增检测试剂盒

英文名：Hepatitis B virus cccDNA Fluorescence Quantitative Polymerase Chain Reaction (PCR) Diagnostic Kit

汉语拼音：yi xing gan yan bing du(HBV-cccDNA) he suan kuo zeng jian ce shi ji he

【目的】

本试剂盒采用核酸扩增技术结合荧光标记探针杂交方法对乙型肝炎病毒cccDNA进行检测，对临床检测具有辅助作用，其检测结果仅供临床参考。

【原理】

本试剂盒采用碱变性法提取病毒DNA，用一对乙型肝炎病毒特异性引物结合一条特异性荧光探针，配以FQ-Buffer(内含Mg²⁺、Tris-HCl等)、耐热DNA聚合酶（Taq酶）、四种核苷酸单体（dNTPs）等成分，用PCR体外扩增法对乙型肝炎病毒cccDNA的恒定区进行扩增，从而达到快速实时定量检测之目的。

【组成】

【标本采集、保存和运输】

1.       全血 用无菌注射器抽取受检者静脉血2-3毫升，注入无菌5ml枸橼酸钠的抗凝管中，反复颠倒3-5次以充分混匀，保存待检。

2.       固体组织(肝组织) 无菌条件下取受检者肝组织约100-500mg左右，转入洁净的1.5ml 离心管中，保存待检。

上述处理后的标本可保存于-20℃，保存期为6个月，-70℃可长期保存。运送应采用0℃冰壶。

【适用仪器】主要包括ABI GeneAmp PCR System7700、ABI GeneAmp PCR System7500, ABI PRISM 7300, LightCycler等，LightCycler等毛细管的仪器，MJ Opticon系列或取得资格认证的定量PCR仪。

【使用方法】

1． DNA提取

1.1 外周血淋巴细胞 应用淋巴细胞分离液(或红细胞裂解液)，分离外周血淋巴细胞，沉淀加入核酸提取液B50μl充分混匀（提取液用前需室温溶解并充分混匀），后100℃裂解10分钟，然后13,000rpm离心3分钟，，取上清液4μl做PCR反应。

1.2固体组织(肝组织) 用生理盐水洗净肝组织表面的血液，取肝组织50mg左右，加入核酸提取液B50μl充分混匀（提取液用前需室温溶解并充分混匀），用研磨器(棒)充分研磨，后100℃裂解10分钟，然后13,000rpm离心3分钟，，取上清液4μl做PCR反应。

3．PCR扩增

从试剂盒中取出HBV–cPCR MIX、Taq酶系，室温融化并振荡混匀后，10,000rpm离心10s。

设所需要的PCR反应管管数为N（N=样本数+1管阴性对照+4管阳性对照），每个测试反应体系配制如下表：

计算好各试剂的使用量，加入一适当体积洁净离心管中，充分混匀，10,000rpm离心10s，向设定的N个PCR反应管中分别加入26μl，向每管中加入处理后样品(所获得的DNA样品)或HBV–c阳性定量标准品(使用前用阴性质控品梯度稀释10倍、100倍、1000倍，记为1×10P^6PCopies/ml，1×10P^5PCopies/ml，1×10P^4PCopies/ml)和阴性质控品4μl，10,000rpm瞬时离心30秒。将各反应管放入定量PCR仪器的反应槽内，按对应顺序设置阴性控品，阳性定量标准品以及未知标本，并设置样品名称、标记荧光基团种类和循环条件：

ABI PRISM 7700，ABI PRISM5700，ABI GeneAmp 7000 (需要剪掉反应盖)，ABI PRISM7300/7500(使用8联管)，MJ Opticon(使用8联管)等使用薄壁管的仪器：循环条件：93℃→2分钟，后93℃ 30秒→55℃ 45秒， 40